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阅微基因成立于2007年，是由国内外多名从事生命科学研究的技术人员创建 ，致力于基因分型和基因检测技术研究 ，为科研用户提供相关的技术服务 。同时，生产了若干优秀的分子生物学产品 ，为科研工作者提供有力的工具。
公司实验室拥有3个实验平台：基因分型技术平台 ，拥有ABI 377 、310遗传分析仪和ABI 3730xl测序仪，提供完备的SSR/STR（微卫星） 、AFLP和SNP的基因分型服务；荧光定量技术平台 ，拥有ABI 7500、7700和罗氏LC480荧光定量PCR仪 ，提供基因表达量检测 、SNP检测和microRNA服务；免疫学技术平台，提供单抗和多抗等抗体制备 、纯化标记、Western Blotting等服务 。
阅微基因是一家中关村高新技术企业，在荧光定量PCR 、SNP 、甲基化方面技术十分成熟 。
实时荧光定量PCR——RT-QPCR
PCR仪的种类
分类总是五花八门 ，总体来说可以分为PCR扩增仪和实时荧光PCR仪两大类 ，有人也把它们称为半自动和全自动，或者定性和定量 ，都是比较不准确的称呼。
PCR最重要的就是个升降温过程 ，最初的水浴锅式PCR，就是三个水浴箱 ，一个机械臂 ，定时抓出反应槽转换水浴锅 。这种东东体积大，迅速慢 ，但其实结果并不比以后的PCR仪差 ，我现在都很欣赏 。后来有人利用致冷和加热做成了，固定位置升降温的PCR扩增仪。
后来随着定量技术的发展 ，有公司将扩增仪和检测做成一体 ，也就成了现在所谓的全自动（或定量）PCR仪 。当然标准的叫实时荧光定量PCR仪 。
品牌
什么东西都有品牌，现在国内国外PCR仪的品牌很多，就国外而言比较著名的有：
ABI美国应用生物公司：老牌的生物公司贵族 ，其收购了原来的PE ，而PE公司是PCR的鼻祖，旗下有很多经典的PCR仪 ，有5700（已停产）、7700（已停产） 、7000 、7900等实时荧光定量PCR仪。
ROCHE罗氏诊断：炙手可热的新贵 ，LIGHTCYCLER是其唯一的PCR仪，市场做得很不错 ，以科研定位为主 ，但在国内很多医院使用，其很特色离心、气加热、毛细管等 ，设计另类 ，是最有特色的PCR仪，当然好坏另议 ，就单其另辟蹊径的技术能力和胆识就值的佩服。
MJ：刚入中国的名流 ，MJ的扩增仪在生命科研领域比较出名，其产品比较适合高通量检测，人类基因组计划用得很多 。其实时荧光PCR仪刚进入中国不久 ，孔间能使用不同温度是其特色 。这点其实比较有用。
伯乐：呵 ，廉价的麦当劳，ICYCLER是其主打 ，进入中国已经比较久了 ，产品和5700一样，是扩增仪上加装定量模块而成 ，特点是价格较低 。
国内现在做的也很多 ，比如杭州博日 、杭州朗基 、上海枫岭、厦门安普利等 。
选购
准确的讲包括实时荧光定量在内都没有自动加样和标本处理系统，只能算半自动的。PCR仪是个简单的东东 ，一个温控设备和一个检测设备而已 。
关于温控 ，主要是介质问题 。理想的介质是导热性好 、比热大 、接触紧密的东东。
这方面最好的是水浴和油浴，比热大（油比水更大）、溶剂化物体 ，与反应物无缝接触 ，效果当然最好 。但是自动化，小型化难，只有最初的水浴锅式使用 。
硅加热 ，这是使用最普遍的一种 ，优点：易自动化 、速度快 、直接加热降温，效果当然好 ，但是第一成本较高 ，第二其使用的介质是金属，导热虽然好 ，但是与反应管 ，很难做到无缝接触，定性时代可以加油 ，但用荧光定最 ，由于油有荧光信号不能用。所以在无缝接触上差一些 。第三由于是底部加热，下部压力较大 ，有溢出的可能 ，不过新的仪器在加热盖以后解决了这个问题 。
空气加热，用空气做介质有优点，与反应体系无缝接触 ，但是空气的导热性差、比热小的弱点明显。因此空气加热的要利用离心来产生空气流动 ，增强导热性，同时使用毛细管 ，加大接触面积 、试剂微量化来弥补。这样做了以后效果还是不错 。但有的厂商把什么离心 、毛细管的好处大讲特讲 ，对气加热的弱点闭口不谈，却是高明的市场手法 。同时 ，使用离心 ，对标本量增大是有影响的并且标本量越大，空气比热小的弱点就越明显 ，所以空所加热的仪器标本量都比较小。使用毛细管后由于反应液与管的接触面积增大 ，吸附现象更大，因此试剂的通用性差一般要专门开发 ，成本高 ，虽然试剂用量少，但因为是专用试剂，每人份就是以实际量算 ，并不省试剂 。反而增加了毛细管成本 。
关于功能 ，所有的PCR仪功能都大体相同。只有MJ孔间能使用不同温度比较独特，这对于多项目同时检测以及循环参数的调整比较有用 。但其实时荧光的仪器刚进入中国不久 ，具体如何还不得而知 。
关于选购 ，根据单位情况而定，由于PCR的技术含量其实并不高 ，好的国产仪器如杭州博日（与日本著名厂商大和有关）也差不太多。关于进口仪器 ，罗氏的仪器不错，但如果标本量大 ，建议不要用罗氏 。一则会累死的 。另外 ，每个标本要分摊的标准曲线、对照成本太高。同时，试剂也比较受限 。
目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用 ，如：扩增特异性分析 、基因定量分析 、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法
SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA 双螺旋 小沟区域的具有绿色 激发波长 的染料 。在游离状态下 ，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此 ，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关 ，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
一、实验前准备：
实验试剂及耗材：
试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA
试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 、LightCycler 480 SYBR Green I Master
1号管包含：
热启动Taq DNA Polymerase 、反应缓冲液、dNTP mix 、SYBR Green I染料 、MgCI2
仪器及耗材：
罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器 、冰盒 、QSP盒装吸头等
正式实验开始前 ，冰上解冻各个试剂注意：SYBR Green I Master 需要避光放置
二、反转录
实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套 ，防止RNase污染 。严格按照试剂盒使用说明进行相关操作 。
按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录 。
(1)配制NTC对照：（总13ul）
水——10ul
oligo dT引物 ——1ul
随机六聚体引物——2ul
混匀
（2）配制1 、2 、3、4号管：（总13ul）
总RNA（s1 、s2 、s3、s4）——1ul
oligo dT引物——1ul
随机六聚体引物——2ul
水——9ul
混匀
Note：可将总RNA的模板量适当调整至10ng—5ug ，mRNA调整至1—100ng 。若RNA样品浓度较低 ，则可加入10ug/ml的MS2 RNA 来稳定模板RNA
（3）将配好的反应mix在PCR仪中65℃变性10min，可有效减少RNA的二级结构。加热后 ，迅速置于冰上制冷 ，放置5min
（4）在反应Templateprimer mix中分别加入以下试剂：
配制总mix（除了RNA模板和引物）
5X反转录酶buffer——24ul（4ulX6管）
dNTP mix ——12ul（2ulX6管）
40U/ul RNase抑制剂——3ul（0.5ulX6管）
20U/ul反转录酶——3ul（0.5ulX6管）
mix总体积——42ul（7ulX6管）
若样品数量多，先配制反应mix再分装到各个反应管 ，小心吹打混匀 ，切勿涡旋震荡 。混匀后于微型离心机上离心，使样品和离心管落至管底 。
将离心管放置PCR仪中，根据使用的引物和目标RNA的长度进行程序设置：
25℃ 10min
55℃ 30min
85℃ 5min
最后置于冰上停止反应。
此反应产物可于2℃—8℃存放1—2h ，或在﹣15℃至﹣25℃下存放更长时间 。cDNA产物无需进行纯化即可用于后续的PCR反应 。20ul的PCR反应体系可取2—5ulcDNA反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有RNase H 活性 ，可以在cDNA合成之后去除RNA模板，减少其对后续PCR的影响
SYBR Green 反应体系的配制：
使用LightCycler 480 SYBR Green I Master使用进行基础的绝对定量分析 。
实验设计：5个标准样品（包含1个空白对照）
5个反转录样品（包含1个NTC对照Negative Template Control缩写）
由于样本数较多 ，如下配置：
不含模板的总体系（594ul）—分装为10管（每管55ul）—每管加入各自的模板（6ul）—每个样分装为3个复管（每管20ul）
按照体系配方配制：
2x Master mix （绿色盖）——330ul（10ulX33）
10x Primer mix ?—— 66ul（2ulX33）
PCR级别水（无色盖）——198ul（6ulX33 ）
总体积 ——594ul
用移液枪轻柔吹打混匀 ，然后分装为10管，每管55ul 。
标准对照组:在各个管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的cDNA ，空白对照加入6ul水代替模板 ，其余加入6ul已经逐级稀释好的标量模板。
反转录样品组:分别加入6ul浓度调整好的模板DNA，包含NTC。
混匀后将每个样按照20ul/孔分装至96孔板中 ，用封口膜盖好96孔板 。将多孔板置于合适的离心机中室温1500g配平离心2min ，然后将准备好的96孔板放入罗氏LightCycler 480中
PCR程序设置与运行：
（1）双击打开LightCycler 480 Software release1.5.0SP4中登录，自动进入软件界面 。
（2）点击New Experiment
（3）设置反应体积（对于96孔板 ，反应体积为10ul—100ul）此次设置20ul
（4）在Program中输入反应名称preincubation ，预备性设置一个循环，无需进行荧光收集
（5）点击增加按钮，输入amplification ，定义扩增循环的次数为445次 ，选择荧光的收集功能Quantification
（6）设定PCR扩增循环的温度与时间为95℃10s
（7）点击增加按钮，设定退火温度为60℃10s
6.7两步 Analysis Mode默认None
（8）设置延伸温度和时间为72℃20s Acquisition Mode选择Single
（9）设置溶解曲线 ，在program新的一行中输入Melting curve ，Acquisition Mode选择Melting Curves 95℃ 5s，新增设置温度 ，再点击增加按钮 ，65℃ 1min 以上两步Acquisition Mode默认选择None
（10）点击增加按钮，95℃?Acquisition Mode选择Continuous ，其他设置无需改动
（11）设置保温的过程cooling ，1个循环，无需荧光 ，40℃ 1min
（12）设置完成后 ，点击右方保存按钮，保存设置的程序
（13）点击start run，开始运行PCR反应 ，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。
样品编辑
（1）实验结束 ，点击Sample editor，进入样本编辑程序
（2）在select Workflow中选择ABs Quant进行绝对定量 ，根据样本在板中的排布方式进行样本编辑 ，设置阴性对照、空白对照 、标准品等，在SELECT Sample中选择样品孔
（3）在Sample Name中输入被选择样品名称
（4）最后点击make replicates设置复孔
（5）标准品设置时 ，需填写拷贝数 、稀释倍数、初始浓度即可
（6）编辑好样品后 ，可进行数据分析，如有需要 ，也可进行组间分析
结果分析
（1）点击左下方的SUM ，将显示出所有信息，包括设置的反应程序 、实验结果分析等 。
（2）点击Analysis ，可对已有的数据进行细致的分析
（3）点击Abs Quant/2nd DerivativeMax ，弹出Create new analysis窗口
（4）在Subset中选择分析样品的区域即可出现分析图，相应样品的扩增曲线
（5）Standard Curve是根据标准品得出的标准曲线，左侧有扩增效率 、斜率、截距 、线性关系以及错误率 （一般error值越小 ，说明实验准确率越高 ，扩增效率如果越接近“2 ”，说明这次的扩增反应越好）
（6）在数据表格 ，可显示样本的Cp值 ，以及相应的样本浓度值，按复孔进行数据统计 ，显示Cp平均值 、方差 ，浓度的平均值以及方差
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